干货整理 | NGS各技术平台介绍汇总
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近年来NGS飞速发展，各大测序平台百花齐放，这里小编整理了从一代测序到现在三代测序的技术发展历程，对各家产品进行了简要介绍，希望对大家了解测序平台有所帮助。
一、基本概念
1、文库
把DNA样本片段化或筛分成指定长度的目标序列，再加上寡核苷酸接头（和条形码DNA片段的大小是NGS文库构建的主要因素。片段化可以通过不同的方法，比如PCR扩增法。（NGS实验流程相对复杂，在过程中会应用到PCR扩增技术） ），用于后续测序上机。
2、读长
被片段化后的DNA链长度，二代测序通常是100-200 bp （bp 是双链DNA碱基对单位）。
3、通量
一次测序上机可以运行的样本（基因）数量。
4、测序深度
一个基因片段被扫描的次数，测序深度深可提高低频突变检出率和检测准确率。
5、全基因组测序
一种生物的全部基因序列的测序，人的基因组序列约3G，基因组是一个细胞或者生物体所携带的全部遗传信息。
6、全外显子组测序
一种生物的外显子序列的测序，外显子测序需要将全基因组外显子区域DNA捕获并富集后进行测序；人的外显子序列只占全部基因序列的1%，约30MB，是基因组的编码序列；相对于基因组测序分析的信息量小，成本较低。
7、转录组测序
细胞内转录产物RNA的测序，广义上包括mRNA、核糖体RNA、转运 RNA及非编码RNA；狭义指所有mRNA的集合。
8、靶向测序
目标区域/序列/位点测序。
二、一代测序简介
1、发生和发展
第一代测序技术是Sanger于20世纪70年代中末期发明的双脱氧链终止测序法，手动测序，用同位素标记，Sanger也因此获得其第2个诺贝尔奖（在Sanger发明双脱氧链终止测序法前Walter Gilbert 发明化学降解法测定DNA序列）； 80年代出现第一台自动化测序设备，荧光标记代替同位素，计算机图像识别； 90年代中期测序仪重大改进，毛细管电泳替代凝胶电泳； 2003年完成人类基因组测序工作。
2、基本原理
以单条DNA链为模板合成互补链，在DNA复制过程中，合成原料（2’脱氧核苷酸dNTP）中掺入标记过的2’3’ddNTP（双脱氧链终止测序法由此而来），就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。经PCR扩增反应，可以得到一系列长度不同的产物，由于ddNTP带有荧光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的仪器进行检测，就可以读出模板的序列。
链终止法反应的核心仍是PCR法。
3、主要平台提供方
ABI公司
三、二代测序简介
1、Roche
454测序: 454测序是大规模平行测序的开始。2003年底，454公司推出了基于焦磷酸测序法 的超高通量基因组测序系统—GenomeSequencer 2.0 System(GS)。2005年454公司被罗氏诊断公司收购，之后优化推出Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。罗森博格博士是该技术的创始人, 也是Ion Torrent平台的创始人。454平台的突出优势是长读长(400nt)，但准确率低，成本高。是高通量测序的过渡。
454 测序技术的具体步骤为：
（1）构建测序文库。将基因组DNA 打碎成300～800 个碱基片段后，在两端加上锚定接头；
（2）PCR 扩增。扩增产生成千上万个拷贝；
（3）焦磷酸测序。复制过程中如果发生碱基互补配对，就会释放1个焦磷酸，在一系列酶的催化下，释放出荧光信号，会被CCD 捕获到。每个碱基反应都会捕获到1 个荧光信号，由此一一对应，模板的碱基序列由此获得。
2、Illumina
Solexa测序方法：由Solexa公司开发，2006年发布，于2007年被Illumina收购，并将测序仪命名商品化为Illumina Genome Analyzer（简称GA）；Illumina不断升级GA，特别是HiSeq系列测序仪的研发完成，由此打破了著名的“摩尔定律”。
基本流程：
（1）构建测序文库。提取基因组DNA，随机打断成100-200bp片段，末端加上接头；
（2）桥式扩增。解链后的单链DNA 片段两端被分别固定于芯片上，形成桥状结构，进行桥式PCR 扩增。经过PCR 扩增，产生数百万条待测的DNA 片段，随后被线性化；
（3）测序。将荧光标记的dNTP、聚合酶、引物加入到测序通道启动测序循环。DNA 合成时，伴随着碱基的加入会有焦磷酸被释放，从而发出荧光，不同碱基用不同荧光标记，读取到核苷酸发出的荧光后，将3 羟基末端切割，随后加入第2 个核苷酸，重复第一个核苷酸的步骤，直到模板序列全部被合成双链DNA。
Illumina 现有二代测序平台：MiSeq、HiSeq2500(1000G)、HiSeq3000、HiSeq4000、NextSeq500、HiSeqX10 (10台HiSeq2500并行)、HiSeq X Five。
3、Life Technologies
SOLID：ABI 于2007年底推出SOLID系统，之后不断升级至SOLID4。 SOLID 测序过程中以连接反应取代聚合反应。
具体测序流程为：
（1）文库制备：将基因组DNA 打断，在其两头加上接头，构建成文库；
（2）乳液PCR／磁珠富集。此过程与454 测序技术类似；
（3）微珠沉积；
（4）连接测序；
（5）数据分析。
454测序、Solexa、Solid 均是边合成边测序原理，454和Solid均有乳液PCR过程。
Ion Torrent:
2007年454技术创始人罗森伯格创办Ion Torrent。Life Technologies 于2010年收购了Ion Torrent，同年推出个人化基因组测序仪PGM。2012年推出IonProton测序仪。Proton更侧重人基因组、外显子组、全转录组测序。PGM测序仪的设计是基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ACGT。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部 时能被检测到。不需要激光、照相机或标记。
现有平台: Solid 3, Solid4(100G), Ion PGM和Ion Proton。
4、华大基因
华大基因收购美国CG公司（Complete Genomics），申请注册BGISEQ-1000和 BGISEQ-100（Ion Proton）
5、深圳华因康
仿SOLiD系统开发了华因康PSTAR-II系统。
6、中科紫鑫
。
此外，贝瑞和康与Illumina合作申报仪器；达安基因与Life Technologies合作申报仪器，CFDA已有批文和相应无创产前诊断试剂。
二代测序技术与一代测序技术相比：
1）一次可对多个样本完成多个基因的检测，是以大规模平行测序为特征，可一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，把平行思想用到极致，突破测序对毛细管电泳的依赖；
2）高通量测序有定量功能，样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。
3）比Sanger技术成本低廉。
Illumina公司和ABI 公司分别推出的Solexa和SOLiD( supported oligo ligationdetetion) 测序技术，与454焦磷酸测序法的原理类似，核心思想都是边合成边测序( sequencing by synthesis，SBS) ，即生成新DNA 互补链时，要么加入的dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。
四、三代测序简介
1、HelicoBioScience
2008年4月，HelicoBioScience 报道了单分子测序技术， 读取单分子荧光的能力，是第一家商业化单分子测序技术的公司，但仪器过于较贵，数据质量较差，于2010年停止运营。
2、Pacific Biosciences
单分子实时技术（single molecule real time, SMRT）利用单分子技术和DNA聚合酶，在聚合反应的同时就可以读取测序产物，在测序速度、读长和成本方面有着巨大的优势和潜力，但目前读取速度偏低。以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征（二代测序平台基于PCR扩增的信号放大过程），长读长，实时，单分子等，但三代测序基于单分子酶学或者单分子电学，信号容易丢失，通量不高，单碱基的测序成本也居高不下。
目前主要有RS II和sequel两款测序仪。
3、纳米孔测序
Oxford Nanopore：纳米孔测序的原理可以简单地描述为：单个碱基通过纳米尺度的通道时，会引起通道电学性质的变化。理论上，A、C、G、T 四种不同的碱基由于化学性质的差异，它们穿越纳米孔时引起的电学参数变化量也有差异，检测这些变化量，即可得到相应碱基的类型。目前主要有MinION、GridION和PromethION这三款测序仪，主要应用于临床上的细菌鉴定、传染病诊断和耐药性检测等领域。
Genia：基于纳米孔测序，2014年6月被Roche 收购
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注：本文转自公众号“基因帮”。
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